En realidad, hay dos preguntas detrás de esta pregunta.
Vamos a empezar con la primera pregunta.
¿Quién descubrió CRISPR?
En 1987, Yoshizumi Ishino en la Universidad de Osaka estaba estudiando el iap del gen de E. coli. Durante sus esfuerzos de secuenciación (recuerden, esto fue en 1987), encontraron esta secuencia de repetición de 29 nucleótidos con un espaciado de 32 nucleótidos.
La frase final del artículo [1]
- ¿Thomas Edison robó los inventos de Nikola Tesla y arruinó su carrera?
- ¿Podría el país (o el mundo) tener demasiados ingenieros / inventores / innovadores?
- ¿Por qué es Thomas Edison más famoso que Nikola Tesla?
- ¿Cómo se patentan los inventos por los inventores?
- Si todos los principales inventores y descubridores a lo largo de la historia (es decir, los hermanos Wright, Newton, Einstein, etc.) no hubieran nacido, ¿el mundo seguiría siendo un lugar similar con los mismos inventos pero de otras personas?
Hasta ahora, no se ha encontrado ninguna secuencia homóloga a estas en ningún otro lugar del procariotas, y se desconoce el significado biológico de estas secuencias.
En la era posterior a la secuenciación en el año 2000, el equipo de Francisco Mojica y Guadalupe Juez en la Universidad de Alicante hizo un rápido análisis comparativo de los genomas de procariotas e identificó una serie de Repeticiones Corta Regularmente Separadas (SRSR) que eran comunes entre múltiples especies. En ese momento, se especulaba si tenía algún aspecto funcional o era simplemente un subproducto ancestral de la evolución. [2]
En 2002, Ruud Jansen de la Universidad de Utrecht encontró de nuevo una repetición de 21-37 pb y, citando el trabajo de Ishino y Mojica, reconoció que estas repeticiones de secuencia corta interpaciadas tienen un espaciado distinto que varía según el organismo. En sus ejemplos citados, Salmonella typhimurium tenía 21 pb, mientras que Streptococcus pyogenes tenía 37 pb. En particular, encontraron que los CRISPR eran exclusivos de ciertos procariotas y no virus ni eucariotas.
En particular, identificaron una secuencia común, GTT / AAC en los extremos de los extremos. Aguas arriba de los loci CRISPR, hubo una larga secuencia homóloga sin un marco de lectura abierto indicativo de un segmento de ARNn conservado. Cerca de allí, se pudieron identificar genes homólogos que se convertirían de cas1 a cas4 . Trabajando con Mojica, se les ocurrió el nombre de Repeticiones Palindormicas Cortas Interspacidas Clustered Regularly (CRISPR) [3]
Entonces se dio cuenta de que Ishino descubrió los primeros loci CRISPR.
Lo que entonces realmente hizo que las cosas se pusieran interesantes y comenzó varias búsquedas. ¿Cuál fue el punto de estos CRISPRs?
En 2006, Eugene Koonin comenzó a escuchar que varios grupos estaban encontrando ADN viral entre las repeticiones CRISPR. La hipótesis original era que los CRISPR estaban asociados con la reparación del ADN. Sin embargo, a partir de las búsquedas bioinformáticas, la enorme presencia de ADN extraño en los espaciadores que se estaban volcando regularmente era indicativa de un mecanismo similar al ARNi. [4] Koonin propuso que CRISPR era un mecanismo de defensa que permitía la memoria inmunológica.
Algunos microbiólogos estaban lo suficientemente locos para escuchar. Rodolphe Barrangou y Philippe Horvath trabajaban en Danisco, una compañía de yogurt, y tenían curiosidad acerca de las estrategias para ayudar a sus cultivos de yogurt a sobrevivir las infecciones virales. Comenzaron a infectar sus bacterias con virus y buscaron ADN viral en los espaciadores CRISPR. Efectivamente, el ADN viral estaba contenido en las células inmunes. Cuando se eliminaron las secuencias de ADN de los espaciadores, se perdió la inmunidad. En 2007, hubo pruebas mecánicas de que CRISPR sirvió como un mecanismo para defenderse contra virus utilizando un mecanismo de acción completamente nuevo. [5]
Para 2010, el mundo de la biología molecular CRISPR estaba explotando. Se determinaría que el sistema CRISPR se comportaría en un determinado patrón.
- El ADN extraño se incorporaría en los loci CRISPR como un espaciador a través de la adaptación CRISPR .
- El grupo CRISPR se expresaría como el pre-ARNcr. El pre-crRNA luego sería procesado por Cas6 / CasE / Csy4. El crRNA maduro se une al complejo Cascade para generar un RNA guía.
- En ese punto, se produce una interferencia CRISPR y el complejo Cascade corta el ARNm y el ADN anteriores utilizando Cas3. [6]
2005-2012 fue este momento increíblemente emocionante para la biología CRISPR. Fue este fascinante campo completamente inexplorado de ncRNAs y con el conjunto adecuado de experimentos, se podían abrir puertas enormes rápidamente con un sencillo artículo de Nature y los grupos se estaban tropezando unos con otros para evitar que alguien los descubriera. Fue una de las áreas más interesantes para la investigación básica en biología molecular.
También diría que nadie estaba listo para lo que iba a suceder a continuación.
Lo que nos lleva a la pregunta real.
¿Quién inventó el sistema CRISPR / CAS9?
Jennifer Doudna no era famosa por CRISPR, sino por resolver una de las estructuras cristalinas más difíciles, la ribozima Tetrahymena Grupo I en 1991, la estructura resuelta del 2do ARN desde el ARNt. Hasta hace poco, se ha especializado en resolver estructuras de ARN. En este punto, si Doudna nunca llegara a ser CRISPR, ya habría tenido una carrera respetable, probablemente ingresando a la Academia Nacional de Ciencias además de toda una serie de premios que ya había ganado antes de ingresar en la investigación de CRISPR.
Debido a su experiencia en bioquímica de proteínas ARN, su grupo comenzó a estudiar ARNs como Argonaute, Dicer y las endonucleasas CRISPR. Poco después de que Barrangou descubriera el papel de CRISPR, un nuevo postdoctorado, Blake Wiedenheft y más tarde Martin Jinek, decidió que sería bueno intentar cristalizar varias proteínas CRISPR. Muy rápidamente, el grupo Doudna pudo generar estructuras de la Cascada CRISRP de varias unidades y, a partir de esas estructuras, identificó las enzimas clave relacionadas con la escisión. [6] En 2009, identificaron a Cas1 como una endonucleasa específica de ADN [7] y en 2010, identificaron a Cys4 como la proteína Cas6 responsable del procesamiento de pre-ARNcr. [8]
Con una idea clara del mecanismo de CRISPR / Cascade, quedó claro que estas proteínas Cas eran endonucleasas que tenían la capacidad de dividir cualquier cadena de ADN en un mecanismo muy similar al del ARNi. En lugar de confiar en el uso de las 6 proteínas Cas de la cascada, intentaron identificar un sistema más pequeño.
Emmanuelle Charpentier era una nueva profesora que estaba estudiando elementos genéticos de acción trans en microbios y se estableció como experta en ARNc reguladores. Al estudiar Streptoccus pyogenes, su grupo identificó una gran cantidad de ARN de CRISPR (tracrRNA) transactivadores que ayudarían a procesar el ARN de CRISPR utilizando una combinación de Cas9 (en el momento llamado proteína Csn1) y RNase III a través del CRISPR de tipo II / Sistema de cas [9]
Poco después de ese trabajo en 2011, Charpentier y Doudna se reunieron en una conferencia y desde esa reunión decidieron iniciar una colaboración para comprender completamente el mecanismo de la proteína Cas9. La colaboración se fortaleció con dos postdocs polacos, Martin Jinek y Krzysztof Chylinski, quienes estaban entusiasmados con la oportunidad de comunicarse con sus compatriotas a miles de millas de distancia. Este equipo aisló la proteína Cas9 e identificó la proteína Cas9 como una endonucleasa de ADN guiada por dos RNA, el tracrRNA y el crRNA procesado en una secuencia específica contenida en el crRNA. Como resultado, el tracrRNA no solo desempeña un papel en el procesamiento de ARNrc, sino que también desempeña un papel en la actividad Cas9 en sí. El ARN bicatenario, así como la secuencia PAM, son necesarios para el reconocimiento de Cas9 del ARNcr. [10]
A través de mutaciones bioquímicas en la proteína Cas9, aislaron los sitios activos y reconocieron que la división se produce en dos dominios, el dominio HNH divide la cadena complementaria, mientras que el dominio RuvC divide la cadena no complementaria. [10]
El experimento realmente clave fue un examen de la estructura secundaria de crRNA y tracrRNA. Al reconocer la estructura, se podría crear una única guía de ARN para crear un sistema que podría activar la endonucleasa Cas9 para inducir roturas de doble cadena. [10]
En ese estudio fundamental, Doudna y Charpentier reconocieron a través de un conjunto de experimentos muy cuidadoso que la endonucleasa Cas9 era capaz de generar roturas de doble cadena, un hallazgo clave que permitiría a los científicos cortar cuidadosamente el ADN en ubicaciones específicas y desencadenar la reparación de la rotura de doble cadena. Esa habilidad le permite a cualquiera insertar un fragmento de ADN de elección. [10] [11] Era junio de 2012.
Una vez que se resolvió el mecanismo y se demostró la prueba de concepto, se logró una carrera masiva para demostrar lo mismo en humanos.
Feng Zhang ya era famoso por su trabajo en el desarrollo de Optogenetics. Al insertar un gen en una célula neuronal, podrían activar células neuronales específicas simplemente al iluminar la posición. Con esa habilidad, un científico podría controlar las acciones de un mono puramente con el interruptor de la luz. A su vez, Feng ayudó a lanzar un campo completo de neurociencia y hasta 2012, fue probablemente el avance de la década. Ya en una carrera joven, Feng estaba en un buen lugar para compartir varios premios con Karl Deisseroth y Edward Boyden por ese trabajo.
Sin embargo, el gran desafío con el sistema era producir neuronas con el gen integrado. Como postdoctorado con George Church, Feng estaba explorando métodos sobre el uso del sistema TALE para apuntar rápida y fácilmente a secuencias de ADN en genomas de mamíferos. Con las primeras realizaciones del sistema de endonucleasa Cas9, era solo una cuestión de tiempo antes de que una forma de hacer que funcionara en humanos fuera posible. Proveniente del grupo de George Church, un grupo que ya estaba bien posicionado para manipular genes, Zhang pudo comercializar rápidamente la técnica.
En enero de 2013, se publicaron 4 juegos de artículos:
- Cong y Zhang 3JAN13 Ingeniería de genoma múltiplex utilizando sistemas CRISPR / Cas [12]
- Mali e Iglesia 3JAN13 Ingeniería del genoma humano guiada por ARN a través de Cas9 [13]
- Jinek y Doudna 29JAN13 Edición de genoma programada con ARN en células humanas [14]
- Cho y Kim 29JAN13 Ingeniería de genoma dirigida en células humanas con la endonucleasa guiada por ARN Cas9. [15]
Que es donde las cosas se ponen realmente complicadas. Debido a su experiencia con la transferencia de tecnología e IP, Zhang pudo obtener la primera y más amplia patente sobre la tecnología CRISPR / Cas9 y ha podido desarrollar el sistema y el software optimizados que la mayoría de los usuarios de la tecnología CRISPR / Cas9 generalmente utilizan. Doudna tiene su propio conjunto de patentes, pero sus reclamaciones se han visto obstaculizadas por la existencia de las patentes de Zhang.
Para no superarse entre sí, cada grupo también ha esclarecido las estructuras cristalinas:
- Jinek y Doudna: 6Feb14 2.6 y 2.2 estructuras angstrom [16]
- Nureki y Zhang 13Feb14 2.5 estructuras angstrom [17]
- Anders y Jinek: 27Julio 14 2.6 estructuras angstrom. [18]
Yo sugeriría encarecidamente mirar este artículo de la revista Quanta, que parece haber investigado más sobre el tema. El avance del editor de ADN Borne of Bacteria | Revista quanta. El artículo del HHMI de 2011 también es una buena lectura de When Worlds Collide.
En conclusión
CRISPR es un nuevo campo de biología que tiene múltiples descubridores clave.
- A Yoshizumi Ishino se le atribuye originalmente la búsqueda del gen CRISPR.
- Ruud Jansen es el que inventó el nombre.
- Eugene Koonin es quien propuso el propósito.
- Rodolphe Barrangou fue quien demostró el papel de CRISPR.
- A Emmanuelle Charpentier se le atribuye la identificación de la importancia de Cas9 y el tracrRNA.
- A Jennifer Doudna se le atribuye la bioquímica para determinar el mecanismo y crear el sistema CRISPR / Cas9.
- A Feng Zhang se le atribuye la humanización y comercialización de la técnica.
[1] Secuencia de nucleótidos del gen iap, responsable de la conversión de isozimas de fosfatasa alcalina en Escherichia coli, e identificación del gen pr … – PubMed – NCBI
[2] Significado biológico de una familia de repeticiones espaciadas regularmente en los genomas de Archaea, Bacterias y mitocondrias
[3] Identificación de genes que están asociados con repeticiones de ADN en procariotas
[4] Un sistema inmunitario basado en la interferencia de ARN putativo en procariotas: análisis computacional de la maquinaria enzimática predicha, analogías funcionales con ARNi eucarióticos y mecanismos de acción hipotéticos
[5] CRISPR proporciona resistencia adquirida contra virus en procariotas
[6] Bases estructurales para el reconocimiento de ADN guiado por ARN CRISPR por Cascade.
[7] Base estructural de la actividad de la ADNasa de una proteína conservada implicada en la defensa del genoma mediada por CRISPR.
[8] Procesamiento de ARN específico de secuencia y estructura por una endonucleasa CRISPR.
[9] Maduración del ARN CRISPR por ARN pequeño trans-codificado y factor huésped RNasa III.
[10] Una endonucleasa de ADN guiada por ARN dual programable en inmunidad bacteriana adaptativa.
[11] Se encontraron tijeras de ADN programables para el sistema inmunitario bacteriano | Laboratorio de berkeley
[12] Ingeniería de genoma multiplexado utilizando sistemas CRISPR / Cas
[13] Ingeniería del genoma humano guiada por ARN a través de Cas9
[14] Edición del genoma programado por ARN en células humanas.
[15] Ingeniería genómica dirigida en células humanas con la endonucleasa guiada por ARN Cas9.
[16] Las estructuras de las endonucleasas Cas9 revelan activación conformacional mediada por ARN.
[17] Estructura cristalina de Cas9 en complejo con ARN guía y ADN objetivo.
[18] Bases estructurales del reconocimiento del ADN diana dependiente de PAM por la endonucleasa Cas9.